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关键词:实验动物学;生物医学;动物模型
1实验动物学在国内外发展现状
由于生物动物学得天独厚的优势,很多多家都早早进行了这方面的研究。英国、美国、日本、法国分别在47、50、53、56年成立生物学研究方向中心。联合国教科文组织与生物科学协会以及医疗科学国际组织联合在1956年成立了国际实验动物委员会,现今已经有45个国家参与。在这些国家努力下,实验动物学的发展十分迅速,甚至早早就设立了独立的科学研究部门。研究实验动物学的部门也越发建立起法律、法规逐步完善教育、管理、科研。这样的有组织的发展,促进了有关生物学的各方面发展。美、日等国家更是专门设立了大规模独立的研究,用于发展生物实验。时间来到近些年,很多国家为了加强实验动物学的发展,都设立的专门的大学来培养人才。医学院、兽医院和很多综合性的大学也孕育而生,为了培养专业的人才,学校都设有高水平、大规模、先进性的设备确保实验中心的研究工作。动物保护协会在动物实验中也提出:Replacement(替代)、Reduc-tion(减少)、Refinement(优化)这三个宗旨。提出实验中尽可能少地使用动物,如果能另寻它法最好。善待动,物对实验动物饲养和管理尽量以最佳条件,使动物实验的设计、操作达到最佳的方案。我国实验动物学的发展近况:我国实验动物研究学起步较晚,1918年元北平中央防疫处刚开始用小白鼠进行防疫试验。20世纪30年代,几个大城市少数的科研单位开始进行小规模的实验饲养。在解放后实验动物工作才算正式发展起来,20世纪50年代为预防各大传染病我国在各地建立起研究单位,并开始大规模的饲养繁殖。1982年我国科委主持召开全国首次实验动物科技的会议,正式将实验动物科技加入规划,先后建立起4个国家级实验动物中心。1987年成立了中国实验动物学会。1988国家科委经国务院批准,颁布了《实验动物管理条例》。1994年国家技术监督局了实验动物的国家标准,从此我国的生物实验动物开始走上了科学、标准的轨道。目前,我国科学工作者在实验动物学方面的研究做了大量工作,当然也取得了很大成就。实验动物的管理条例也愈发成熟,各级省、市、自治区都成立了实验动物管理机构。并各大医学院校设立了实验动物学课程,一些院校还设立了实验动物专业,并且招收硕士、博士研究生。中国政府和日本合作开设中国实验动物培训中心,培训出了大批良好的人才。我国培训这些人才,都为实验动物科学的发展起到了至关重要的作用。据1995年不完全统计,全国生产大鼠、小鼠、豚鼠、兔、犬、猴、地鼠、猪、SPF鸡等实验动物约900万只。在数量上大部分地区基本可以满足科技工作的需要,实验动物的生产已开始向企业化、商品化、社会化方向发展。
2动物模型的优越性
2.1避免在人身上进行实验带来的风险
临床试验是最有效果知道试验结果的医学方式,但是临床上外伤、中毒等试验研究是十分有难度的。还有急性和慢性呼吸系统疾病等不可能在人身上反复试验的。因此动物可以作为人类的试验者,在工作人员反复研究下可以反复观察试验体的情况进行研究。克服人类在研究中遇到的伦理和社会限制问题,试验中可能为了试验需要损伤动物器官或处死动物。
2.2可以严格控制实验条件
临床上很多疾病是复杂的,就来一个换有肾脏疾病的病人来说,他也同时患有心脏病或肺脏疾病。即使患有同样疾病的两个人也会因自身的特点年龄、性别、体重、健康状态等等原因疾病的发展而产生千差地别的影响。而动物就能克制这些因素的发生,各方面的因素甚至湿度、温度、私聊方面都能严格控制。无论是在营养学、卫生学、肿瘤学、环境等方面,同一时期内很难在人身上取得一定数量的定性疾病材料。动物模型不仅仅在数量上可以得到满足,而且还可以通过投服一定剂量的药物或移植。
2.3有利于全面认识疾病的本质
临床研究多会有局限性,病原体的感染会应为动物的不同而表现出不同的特点。通过人畜感染患病比较研究,可以研究出同一病原体对不同机体带来各种损害、不良反应。从中工作人员能发现某种疾病的本质,有利于解释在人体上的病历变化。动物疾病模型的另一个成效的用途:能仔细观察环境或遗传因素对疾病发生后的发展情况,对于全面地认识疾病本质有重要意义。
3结论
在初中物理教学中,无论是教师演示实验还是学生分组实验经常有失败现象甚至是事故发生.究其原因,有的是实验仪器准备不当,没有考虑器材的适用条件;有的是实验条件或因素考虑不周,照搬书本理所当然地进行实验;有的是实验操作方法不够熟练,教师在课前未做充分演练;有的是设备故障或遇到偶发事件,实验无法继续进行等等.遇到实验失败,是遮掩搪塞或一带而过,还是抓住时机分析失败原因,是课堂教学中经常遇到的问题.
在课堂宝贵的45分钟时间内,实验的失败经常会让师生感到沮丧.但是,换个角度看待问题,则可以将课堂教学的“失败”之处转变为成功之处,从而朝着有利于物理教学的方向发展.
1 以失败原因为契机,帮助学生突破知识难点
夜上海论坛 学生实验时,教师习惯于给学生做好前期准备工作,强调注意事项,让学生顺着教师的“意图”进行实验,从而节省时间,便于得出结论.殊不知,这样做很可能把一些本该需要突破的教学难点给忽略了,没有充分利用好实验机会.所以,针对一些知识难点,教师可以设置一些失败实验为教学契机,帮助学生巩固、加深理解物理知识.
例如,在“探究凸透镜成像的规律”时,选好透镜并将器材组装到光具座上时,要做一个关键操作:使烛焰和光屏的中心位于凸透镜的主光轴上,然后才能进行后面的操作.但很多学生不理解这一步的重要性,为此,笔者在进行本实验教学时,有意安排了如下教学片断:让学生按教师演示的进行操作,将蜡烛、透镜、光屏从左到右依次组装在光具座上.先将蜡烛放在距离透镜较远处,调节光屏到凸透镜的距离,使烛焰在光屏上成清晰的像,并注意观察像的大小、正倒.学生按要求进行实验时,有一组无论怎么移动光屏,都无法在光屏上得到像,笔者发现他们组装的仪器如图1所示,就将该组器材展示给全班学生,并与自己组的比较下,启发他们找出其中的原因.有学生认为该组的凸透镜装的太高了,而烛焰和光屏太低了,应该使三者一样高.笔者当即表扬该生的发现并请该组学生自己改进实验装置.
夜上海论坛 在探究“分析实验数据,在什么情况下可以得到倒立、等[HJ1.4mm]大的实像”时,绝大多数小组都能通过实验发现:当光屏上成倒立、等大的实像时, 可得U=V=2f.但有一组发现上述结论好像不成立,提出了异议,只见他们组装的器材如图2所示.笔者将其展示,提问这是为什么?学生议论纷纷,各抒已见,笔者顺势指出:这样放置,光具座上蜡烛到透镜的距离并不是实际的物距,实际物距应是烛焰到透镜中心的距离.经过这样的原因分析,笔者强调,实验过程中应注意使烛焰、透镜中心与光屏中心“等高、共轴”.学生终于知道了实验失败的原因所在,事实证明,学生今后对这个问题就不再只知表面不知内因了.
夜上海论坛 2 以失败现象为抓手,培养学生分析解决问题的能力
物理课程标准列出了学生必做的一些实验,而学生实验的主要目的就在于鼓励学生积极动手、动脑,体验学习科学的乐趣.特别是电学实验,学生实验的兴趣很高,但是失败的情况也很多,甚至是意想不到的.教师自己要有充分的实验知识和操作能力,在鼓励学生自己分析解决问题的同时,必要时点拨或帮助一下学生,让学生有信心继续实验.
夜上海论坛 例如在进行“测量小灯泡的功率”教学时,学生按照电路图连接好实验仪器后,闭合开关,有几组发现电灯不亮.其中有位学生马上举手说“老师,电灯怎么不亮啊”,笔者示意他先自己找找原因.有一组发现电流表和电压表均有示数,将滑动变阻器的滑片移动一段距离,但电灯就是不亮,反复检查后显得很焦急,急欲寻求帮助.这时,笔者给他们点拨,你们用的滑动变阻器是“50 Ω 1.5 A”的,滑片移动一段后,变阻器接入的阻值仍较大,使小电灯两端的电压和流过的电流都非常小,所以发现两表有示数,但小电灯就是不亮.学生再次实验后恍然大悟,更加投入后面的实验了.还有一组连好合上开关后,电表、电灯都不工作,将旋钮接线反复调试几次都失败了,甚至换了个小电灯也一样,笔者顺势提问:我们来探究下电路为什么不通?学生的兴趣立即上来了,针对器材一一分析:可能是电源坏了;可能是滑动变阻器断了;可能是开关断路;可能导线出问题了……笔者继续提问:那有什么方法来判断故障在哪呢?学生开始逐个更换电源、滑动变阻器、开关等器材,电灯还是不亮.最后笔者提示,我们有没有什么简单的方法呢?有学生提出用一根导线并联在各部件的两端,一个一个地查,终于发现是其中一根导线断了.换用另一根导线后,实验就成功了.学生经历了尝试解决问题的过程后,动手实验的积极性提高了,学到了书本没有的东西,同时也培养了学生耐心分析问题、勇于解决问题的学习能力.
3 以失败结局为教训,培养学生严谨的科学态度和科学精神
夜上海论坛 数学家华罗庚说过:失败是经常的,关键是要把每次失败作为前进的梯子,继续攀登.学生实验中,遇到失败要做到不灰心、不气馁、不放弃,要积极分析原因,不断尝试,努力培养勇于探索的科学实践精神.
夜上海论坛 例如,在“探究使用动滑轮的特点”实验中,学生将几个钩码挂在动滑轮下面后,开始测绳子自由端的拉力.有的组未将弹簧测力计调零就进行测量;有的组受前面定滑轮实验的影响,斜拉绳子向上运动等等,发现测出的数据都不能得到F=[SX(]G物+G动[]2[SX)]的结论.笔者让失败的几组研读实验要求,分析问题出现的原因,改进后重新实验,取得了较好的实验效果.类似的例子还很多,一些看似简单的实验,如果操作方法不严谨,抱着“玩”的心态操作,很容易造成实验的失败.又如在“测量小灯泡的电功率”实验中,不少学生操作太随意,经常将小灯泡烧坏,然后仍在一旁不管了,其实很多情况下他们连怎么会烧坏都稀里糊涂.教师应该及时抓住这样的机会进行教育,让学生认识到实验操作的规范性、严肃性,树立严谨的科学态度和科学素养.另外,在一些测量性实验中,教师应该教导学生遵守实验纪律,尊重实验事实,不要为了得到漂亮的结论而弄虚作假,养成实事求是的科学精神.
夜上海论坛 关键词:动物细胞;无血清培养基;实验设计
中图分类号:R-332文献标识码:A文章编号:1673-2197(2009)02-0021-03
夜上海论坛 动物细胞培养技术是当今生物工程领域中的前沿研究课题之一,无论是在基础研究还是生产实践方面都得到生物技术界的重视。随着哺乳动物细胞培养规模的扩大和生物药物需求的增长,基于细胞及产品特性的无血清培养基的研制已成为细胞工程领域的重要课题。无血清细胞培养技术的研究日益得到人们的重视。近年来,有关无血清培养基的研制和开发得到了迅速发展,推动了基因工程产品及产业的发展。
1 无血清培养基的优势特点及分类
细胞培养基是细胞体外培养的最重要因素。无血清培养基是继天然培养基、合成培养基之后的第三类培养基。与传统的培养基相比,无血清培养基是一种不含有动物血清或其他生物提取液,但仍可以维持细胞在体外较长时间生长、繁殖的一种培养基。无血清培养基由于其组成成分相对清楚,制备过程简单,在现代生物技术学领域得到广泛应用。无血清培养技术也是阐明细胞生长、增殖、分化及基因表达调控的基础研究问题的有力工具。
常规细胞培养基的制备方法是在基础培养基中添加相应量的血清或组织提取物,其中最常用于培养基的血清是一种组分很不明确的混合物。所以常规血清细胞培养基存在以下缺点:
夜上海论坛 (1)血清来自于动物体,其对细胞在体外培养时的主要作用是提供生长因子、激素、结合蛋白,并提供保护作用,但同时也有细胞生长抑制因子和毒性因子,所以存在潜在毒性。
夜上海论坛 (2)由于动物血清提取的局限,使其应用于培养基的价格格外昂贵。
(3)动物血清提取的局限,也给细胞培养的标准化带来困难,同时也存在细胞培养表达产品分离纯化难的问题,具有潜在的细胞毒性作用,给规模化培养细胞增加了难度[1]。
夜上海论坛 由于上述常规血清细胞培养基存在的诸多问题,促使我们改进培养方法,用无血清细胞培养基来替代。细胞工程中无血清培养技术的应用,在很大程度上可以避免含血清培养所带来的不利。无血清培养基具有以下明显的优缺点:
夜上海论坛 无血清培养基的优点:
(1)可避免血清批次间的质量变动,提高细胞培养和实验结果的重复性。
(2)避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染。
夜上海论坛 (3)避免血清组分对实验研究的影响。
(4)有利于体外培养细胞的分化。
(5)可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。
缺点:
(1)细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响,培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便。
(2)成本较高。
(3)针对性很强,一种无血清培养基仅适合某一类细胞的培养。
发展无血清培养基,除了开发化学合成培养基外,也可以寻找适当的具有类似于血清功能的生物分子来替代血清。目前,无血清培养基的研究有两个方向:一是培养基中不含有任何动物来源的添加组分;二是培养基中不含有不明确的添加组分。依次可以将当前应用较多的无血清培养基归纳为以下4种:
(1)无血清培养基。此为一般意义上的无血清培养基,是由各类可替代血清功能的生物材料配制成的细胞培养基,如牛血清白蛋白(BSA)、转铁蛋白、胰岛素等生物大分子物质,以及从血清中提取的去除蛋白质的混合脂类以及水解蛋白等。其特点是培养基中的蛋白含量较高,添加物质的化学成分不明确,其中含有大量的动物来源蛋白[2]。
(2)无动物来源培养基。许多商业公司开发的无动物来源培养基是基于生产重组药物的安全考虑,培养基中的添加组分无动物来源,需要的蛋白来源于重组蛋白或者蛋白水解物,这些组分可以保障细胞生长及增殖的需要。
夜上海论坛 (3)无动物蛋白培养基。培养基完全不用动物来源的蛋白,但仍有部分添加物是来源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片段等其他衍生物。此类培养基组分相对稳定,但必须添加类固醇激素和脂类前体,并且对培养的细胞是高度特异性的[3]。
(4)化学组分限定培养基[4,5]。此类培养基是目前最安全、最为理想的培养基,首先可以保证培养基批次间的一致性,其中所添加的少量动物来源的蛋白水解物、蛋白都是成分明确的组份。其特点是培养基的性质明确,有利于进行细胞培养的代谢研究,同时分离纯化也比较方便。
夜上海论坛 2 无血清培养基的实验研究
无血清培养基是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求,但对有些实验却不适合,如观察一种生长因子对某种细胞的作用,这时需要排除其他生长因子的干扰作用,而血清中可能含有各种生长因子;又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质(抗体、生长因子)的能力;或者要大规模的培养某种细胞,以获得它们的分泌产物。
2.1 无血清培养基的基本配方
基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。用于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时,多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长;而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时,由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白,细胞往往以悬浮形式生长。
2.2 添加组分
2.2.1 促贴壁物质
许多细胞必须贴壁才能生长,这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子,一般为细胞外基质,如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子,对许多细胞的繁殖和分化,起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化,这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。
夜上海论坛 2.2.2 促生长因子及激素
针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质,有些激素是许多细胞必不可少的,如胰岛素。
夜上海论坛 2.2.3 酶抑制剂
夜上海论坛 培养贴壁生长的细胞,需要用胰酶消化传代,在无血清培养基中酶抑制剂必不可少,以终止酶的消化作用,达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶抑制剂。
2.2.4 结合蛋白和转运蛋白
常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大,可增加培养基的粘度,保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。
2.2.5 微量元素
硒是最常见的微量元素。
2.3 使用方法
夜上海论坛 目前,血清仍是动物细胞培养中最基本的添加物,尤其是在原代培养或者细胞生长状况不良时,常常会先使用有血清的培养液进行培养,待细胞生长旺盛以后,再换成无血清培养液。细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程,一般要逐步降低血清浓度,从10%减少到5%,3%、1%,直至无血清培养。在降低过程中要注意观察细胞形态是否发生变化,是否有部分细胞死亡,存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。在实验后这些细胞一般不再继续保留,很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。细胞转入无血清培养之前,要留有种子细胞,种子细胞按常规培养于含血清的培养基中,以保证细胞的特性不发生变化。
夜上海论坛 为了使细胞适应无血清培养,关键是使所培养细胞处于如下状况:
(1)处于对数生长中期;
(2)>90%活细胞率;
(3)适应时以较高的起始细胞接种。
细胞适应无血清培养基的方法:
直接适应――细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基(SFM)中。
夜上海论坛 一些类型细胞可直接从包含血清的培养基适应无血清培养基。对于直接适应,接种细胞密度应该:2.5×105-3.5×105细胞/mL。当细胞密度达到1×106-3×106细胞/mL时,传代培养细胞。当细胞密度在培养4~7天后达到2×106~4×106细胞/mL时,细胞完全适应了无血清培养基。每隔3~5天,当细胞密度达到1×106~3×106细胞/mL,细胞活率在90%时,贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。
连续适应――分好几步把细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基(SFM)中,与直接适应相比较,连续适应趋向对于细胞更加温和一些。
(1)以2倍正常接种密度接种生长活跃的细胞培养物到75%有血清培养基-25%SFM混合培养基中,传代培养。
夜上海论坛 (2)当细胞密度>5×105细胞/mL时,以2×105~3×105细胞/mL细胞密度,在有血清培养基:SFM为50∶50的混合培养基中传代培养。
(3)以2×106~3×106细胞/ml细胞密度,25%有血清培养基和75%SFM中传代培养。
(4)当细胞密度达到1×106~3×106细胞/mL(接种后4~6天),在100%SFM培养基中传代培养。
(5)每隔3~5天,当细胞密度达到1×106~3×106细胞/mL,细胞活率在90%时,贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。
建议备份前一次混合培养的培养物,直到每一次细胞适应了新的混合培养基。每一次减少血清前,可能需要在SFM/有血清混合培养基中进行几次传代。
在适应过程中,最好不要让细胞生长过度。这将增加选择亚群的可能性。需要注意,与有血清培养基相比,大部分SFM包含非常少的蛋白质,因而更易于受外界因素的影响。
细胞培养适应替代血清:许多细胞利用连续适应方法能很好的适应,用包含FBS的培养基和包含有替代血清的培养基1∶1(v∶v)的混合培养基培养细胞。通过下列的混合培养基的方式,连续几代减少当前培养基的量:从1∶2到1∶4再到1∶16直至100%替代培养基。每次适应改变血清比例时,传代细胞2~3次。
夜上海论坛 培养直接从FBS转换到替代血清。一开始就使用相同于FBS的浓度的替代物或血清,生长的延迟可能会发生,允许进行2~3次的传代,使生长率恢复到以前的水平。
特别需要强调的是:配制无血清培养液必须使用高质量的水,如石英玻璃蒸馏器经3次蒸馏或超纯水净化装置制备的水。因为无血清培养基缺乏血清中天然成分未中和毒素、保护细胞的大分子,既便水中的有毒物质含量甚微,也可能对细胞产生致死性损害。这是无血清培养能否成功的关键因素之一。
3 结语
夜上海论坛 动物细胞无血清培养基的研究方法运用了基因组技术、蛋白质组技术、代谢工程技术、计量分析方法等。另外,有关无血清培养基在线数据库的建立也方便了相关信息的检索与分析[6],为无血清培养基的设计提供了更多的信息。
随着重组蛋白、单克隆抗体及病毒疫苗需求量的加大,将会有更多的科学方法运用到细胞培养基的设计与研究中[7]。新一代动物细胞无血清培养基将具有“无血清、无蛋白、无动物来源、成分确定”的特性,同时在功能上属于安全、通用的高效培养基,这种细胞无血清培养基在细胞工程领域中将会得到广泛应用。
参考文献:
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夜上海论坛 [2] Keen M J,Rapson N T. Development of a serum-free culture medium for the large scale production of recombinant protein from a Chinese hamster ovary cell line[J]. Cytotechnology,1995,17 (3) :153-163.
夜上海论坛 [3] Schroder M, Matischak K, Friedl P. Serum-and protein-free media formulations for the Chinese hamster ovary cell line DUKXB11[J]. Journal of Biotechnology,2004, 108 (3): 179-292.
夜上海论坛 [4] Hesse F, Wanger R. Developments and improvements in the manufacturing of human therapeutics with mammalian cell cultures[J]. Trends Biotechnology,2000, 18 (4): 173-180.
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