向日葵叶片生理生化分析范文

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夜上海论坛《中国油料作物学报》2015年第六期

摘要:

为了明确向日葵对菌核病菌毒素的生理生化抗性机制，测定了粗毒素液体浸根处理后，不同抗性向日葵品种丰葵杂1号(FKZ1)和7101的叶片几丁质酶、β－l，3－葡聚糖酶活性和丙二醛、可溶性糖、游离脯氨酸、木质素的含量及组织细胞膜透性的变化。毒素处理后，向日葵叶片几丁质酶和β－l，3－葡聚糖酶的活性，丙二醛、可溶性糖、游离脯氨酸、木质素的含量显著提高，以上几种物质除丙二醛外，抗病品种与感病品种相比升高的速度快，幅度大。同时毒素可显著破坏植株细胞膜透性，抗病品种细胞膜的耐损伤能力强于感病品种。研究表明几丁质酶和β－l，3－葡聚糖酶的活性，可溶性糖、游离脯氨酸、木质素含量和细胞膜的耐损伤能力与向日葵对菌核病的抗性呈正相关，丙二醛含量与向日葵对菌核病的抗性呈负相关。

关键词:

向日葵;菌核病;毒素;生理生化

草酸是菌核病菌分泌的有毒代谢物，早在1886年，deBary［1］便认为草酸毒素与菌核病菌的致病性有关，其在感病的胡萝卜组织中检测到草酸钙。Noyes等［2］在对向日葵核盘菌的致病性研究中发现感病的向日葵叶片中草酸含量是健康叶片的1．5倍。吴纯仁等［3］通过扫描电镜观察证实了草酸对油菜菌核病的致病作用。刘秋等［4］报道向日葵菌核病菌在离体、活体培养条件下均能产生草酸毒素，该毒素对种子萌发、胚轴伸长和幼苗生长等都有毒害或抑制作用。目前，草酸作为菌核病菌分泌的毒素，被认为是菌核病致病的决定因子［5，6］。据报道，外源草酸可诱导油菜体内与防卫反应有关的酶的活性变化，这些酶活性的变化与草酸的致病机制和油菜的抗病机制有密切的关系［7］。前人在油菜和大豆等作物上对草酸毒素产生的培养条件［8］、致病性［9］、致病机制［10］、寄主的抗病机制［11］都有很多研究。关于向日葵菌核病仅见有关毒素产毒条件及生物测定方法的报道［12，13］，而对于向日葵核盘菌产生的草酸毒素对寄主的生理影响和品种的抗病机制等方面研究较少。因此本研究通过对向日葵抗、感品种经草酸毒素处理前后几种酶活性、生化物质含量的变化以及细胞膜透性进行测定，探讨向日葵生理生化方面的抗病机制，为选育抗病品种、有效控制向日葵菌核病提供理论基础和科学依据。

1材料与方法

1．1品种及菌株向日葵品种为丰葵杂1号(FKZ1，抗病)，7101(感病)［14］，由黑龙江省农业科学院植物保护研究所免疫室提供。向日葵核盘菌菌株YS1，2013年田间采集并分离纯化培养。

夜上海论坛1．2培养基PDA培养基:马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，121℃高温湿热灭菌30min。PD培养液:马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，121℃高温湿热灭菌30min后备用。

夜上海论坛1．3粗毒素的制备将菌株YS1接种于PDA培养基平板上22℃培养2～3d，用打孔器取直径1cm带有菌丝的小块移入装有100mLPD培养液的250mL三角瓶中，22℃恒温振荡培养10d后，用双层纱布过滤产毒培养液，所得滤液再用滤纸过滤一遍，滤液经高压灭菌即为粗毒素，4℃冰箱贮存待用。

夜上海论坛1．4草酸毒素的测定方法首先将粗毒素用无菌水定容到100mL，充分混匀后，取50mL粗毒素于三角瓶中，加50%CaCl2溶液1mL，加热5～10min，放置24h，待其充分沉淀后，将溶液1600×g离心10min，弃去上清液用无菌水反复冲洗后，将沉淀溶于5mLH2SO4中(水∶硫酸=9∶1)，待沉淀充分溶解后，将溶液移入滴定瓶中，加入1mL10%MnSO4溶液，加热到65℃，用1．58g/LKMnO4滴定该溶液，直至显出玫瑰色，并且几秒内不褪色，计算草酸含量(1mL1．58g/LKMnO4相当于0．145mg草酸H2C2O4)［15］。本试验草酸浓度为0．0036g/L。

1．5取样及生理指标测定方法将在无菌土中培养长至六叶期的丰葵杂1号和7101的向日葵幼苗移入装有草酸毒素的试管中，每处理每品种各取8株长势一致的幼苗，每试管1株，置4000Lux、25℃光照培养箱中培养，光照时间16h/8d，以无菌水处理的幼苗为对照，分别在处理0、12、24、36、48、60、72h摘取毒素处理和对照处理的向日葵第一片真叶［16］，采用DNS还原方法测定几丁质酶和β－l，3－葡聚糖酶的活性［17］;采用TBA反应法测定丙二醛含量［18］;采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量［19］;采用冰醋酸反应法测定木质素含量［20］;采用茚三酮试剂法测定游离脯氨酸含量［21］;用相对电导率测定细胞膜透性［22］。

1．6数据统计分析夜上海论坛采用DPSv7．05版统计分析软件，按照单因素随机设计的方差分析模型，用Duncan氏新复极差法对同一时间不同处理的数据进行差异显著性分析。

2结果与分析

2．1毒素对叶片几丁质酶和β－1，3－葡聚糖酶活性的影响向日葵不同品种经毒素处理后，叶片中几丁质酶活性发生明显变化(图1)。抗病品种丰葵杂1号叶片几丁质酶活性变化趋势为先显著升高而后逐渐下降最后趋于平稳，几丁质酶活性高峰出现在处理36h;感病品种7101的几丁质酶活性在36和60h出现两个高峰，2个向日葵品种的几丁质酶活性都显著高于对照。抗病品种丰葵杂1号的几丁质酶活性在各取样时间段均高于感病品种，说明毒素可诱导几丁质酶活性增加的效应在抗病品种上更为突出。毒素处理后，2个向日葵品种β－1，3－葡聚糖酶活性都显著高于对照(图2)。抗病品种β－1，3－葡聚糖酶活性高峰出现在毒素处理36h，感病品种β－1，3－葡聚糖酶活性在36和60h出现两个高峰，毒素处理36h，抗病品种和感病品种β－1，3－葡聚糖酶活性与对照相比分别增加了368．6%和248．6%。说明向日葵菌核病菌毒素可以诱导向日葵幼苗体内β－1，3－葡聚糖酶活性增加，抗病品种β－1，3－葡聚糖酶活性增加值显著高于感病品种(P＜0．05)。

夜上海论坛2．2毒素对叶片内丙二醛、木质素、可溶性糖和游离脯氨酸含量的影响毒素处理可导致2个向日葵品种的丙二醛含量都显著高于对照(图3A)。毒素处理36h，抗、感品种叶片内丙二醛含量分别达到峰值，丰葵杂1号丙二醛含量较对照提高26．4%;感病品种7101丙二醛含量较对照高出80．6%。抗、感品种之间相比，除在毒素处理12h丙二醛含量无明显差异外，其它各时间段丙二醛含量均差异显著(P＜0．05)，说明向日葵菌核病病菌毒素可以导致向日葵幼苗体内丙二醛含量的增加，且感病品种增加幅度大于抗病品种。毒素处理后抗、感品种木质素含量变化总趋势为先升高后下降(图3B)。毒素处理12h后，抗病品种木质素含量与对照相比差异不显著(P＜0．05)，处理24h后，木质素含量显著升高，当处理48h，抗病品种木质素含量达到峰值，与对照相比增加了156．6%，随后逐渐下降，但显著高于对照(P＜0．05)。经毒素处理的感病品种叶片组织内木质素含量在各时间段取样均显著高于对照，当处理48h，感病品种木质素含量达到峰值，与对照相比增加了155．9%。说明向日葵菌核病菌毒素可以诱导向日葵幼苗体内木质素含量的增加。向日葵不同品种经毒素处理后，叶片可溶性糖含量变化趋势为先升高后下降(图3C)。毒素处理12h后，抗病品种可溶性糖含量与对照相比差异不显著，处理24h后，可溶性糖含量显著升高，当处理36h，抗病品种可溶性糖含量达到峰值为4．973%，此时，感病品种的可溶性糖含量也达到峰值3．457%，与对照相比抗、感品种可溶性糖含量分别增加了124．7%和73．4%，抗病品种可溶性糖的增加量显著高于感病品种(P＜0．05)。毒素处理后，2个向日葵品种的游离脯氨酸含量都显著高于对照(图3D)。抗病品种丰葵杂1号的游离脯氨酸含量在48h和72h出现2个高峰;感病品种7101的游离脯氨酸含量高峰出现在处理48h。2个品种相比较，各取样时段抗病品种的游离脯氨酸含量都高于感病品种(P＜0．05)。

夜上海论坛2．3毒素对叶片细胞膜透性的影响毒素对向日葵叶片细胞膜有明显的毒害作用(图3E)，毒素处理后2个向日葵品种的相对电导率都显著高于对照(P＜0．05)。随着处理时间的延长，电导率值随之增加，对叶片细胞膜的毒害作用逐步加大。毒素处理后抗病品种的相对电导率一直低于感病品种，说明抗病品种细胞膜对毒素的耐受能力要强于感病品种。

3结论与讨论

夜上海论坛病程相关蛋白(pathogenesis－relatedprotein)是植物受病原菌侵染或不同因子刺激胁迫产生的一类诱导性蛋白质，其中几丁质酶和葡聚糖酶被认为是在抗病过程较为关键的两种防御蛋白。核盘菌菌丝细胞壁的主要成分是几丁质和葡聚糖，能被几丁质酶、葡聚糖酶水解，从而减轻病原菌对植物的侵害。张学昆等［23］发现，几丁质酶以脱乙酰化几丁质为底物时活性最高，而对乙酰化程度较高的几丁质和菌核病菌细胞壁的活性较低，导致了油菜对菌核菌的抵抗力不高。张笑宇等［24］用黑痣病菌毒素处理马铃薯幼苗结果表明，黑痣病菌毒素诱导几丁质酶和β－1，3－葡聚糖酶活性升高，但几丁质酶和β－1，3－葡聚糖酶活性变化不是引起品种抗性差异的主要原因。这与本试验结果略有不同，本研究结果表明向日葵经草酸毒素处理后，抗、感两个品种体内的几丁质酶和葡聚糖酶活性都显著提高，抗病品种丰葵杂1号的几丁质酶活性在各取样时间段均高于感病品种，并且抗病品种β－1，3－葡聚糖酶活性增加值也显著高于感病品种。所以笔者认为菌核病菌毒素可诱导几丁质酶和β－1，3－葡聚糖酶活性增加的效应在抗病品种上更为突出。木质素在细胞壁中的积累可使细胞壁加厚，木质化作用可增加细胞壁的韧度，提高植物抗病原菌侵入能力;脯氨酸在植物体内除了起渗透调节作用外，还可提高蛋白质水溶性、稳定蛋白质结构，清除自由基等。本研究结果表明向日葵品种的抗病性与防卫反应活跃阶段木质素和游离脯氨酸含量的增加有密切的关系，二者呈正相关关系。丙二醛是膜脂过氧化的最终产物，丙二醛的大量累积可对生物膜造成不可逆的损伤，加快病原菌对植物的侵染速度［25，26］。

夜上海论坛台莲梅［27］研究了茄链格孢菌(nariasolani)毒素对马铃薯叶片丙二醛含量的影响，发现毒素处理马铃薯叶片后可明显增加叶片内丙二醛含量，并且在感病品种上表现尤为明显，这与本研究结果一致。本试验表明经菌核菌毒素液处理向日葵叶片其体内丙二醛的含量显著升高，感病品种丙二醛含量增加幅度大于抗病品种，进一步证明了菌核病菌毒素加速了细胞膜的损伤，使细胞内电解质泄漏剧增，叶片出现不可逆的损伤症状。关于寄主植物受胁迫后可溶性糖含量的变化与抗病性的关系已有许多报道，但在不同的病害中研究者得出的结论不一致。吴晓丽等［28］对花椰菜幼苗抗黑腐病生理机制研究表明幼苗接菌处理后抗病品种的可溶糖含量低于感病品种。李赤等［29］对富贵竹中可溶性糖含量与细菌性茎腐病的关系研究结果表明，寄主感染病原物后可溶糖含量与品种抗病性成正相关。本研究结果也表明，经向日葵菌核病菌毒素处理后，可溶性糖含量与向日葵品种抗病性成正相关。细胞膜透性的改变在一定意义上反映了细胞膜结构受损伤程度。本研究发现菌核病菌毒素可改变向日葵叶片细胞膜的透性，造成电解质外渗，并且随着病菌毒素处理时间的延长，细胞膜透性逐渐增大，说明菌核病菌毒素对向日葵叶片细胞具有一定的破坏作用，这种破坏作用在感病品种上更为明显。

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夜上海论坛作者：刘佳 张匀华 孟庆林 石凤梅 马立功 李易初 左豫虎 单位：黑龙江八一农垦大学 黑龙江省农业科学院植物保护研究所