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1材料与方法
1.1方法
1.1.1STAT3-shRNA慢病毒表达载体的构建选择GenBank提供的STAT3基因序列(NM_139276.2)为靶基因,委托上海纽恩公司设计多个RNA干扰靶点序列,结合设计软件评估测定结果及公司设计经验,最终确定并合成shRNA序列:5’-AACTTCAGACCCGTCAACAAA-3’,进一步合成双链DNAoligo,退火后与AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切载体pLKD.CMV.G&PR.U6.shRNA连接,转化细菌感受态细胞,对长出的克隆进行PCR鉴定,测序比对正确后,抽提重组质粒,与包装质粒psPAX2、外膜质粒pMD2.G共转染293T细胞完成病毒组装。离心去除细胞碎片并用0.45μmPESfilterflask过滤收集上清液,100000×g,4℃超速离心2h后得到浓缩的STAT3-shRNA病毒液。同法构建阴性对照病毒。进一步梯度感染293T细胞,荧光显微镜下计算绿色荧光蛋白(greenflu-orescentprotein,GFP)数目,计算病毒滴度。测得干扰病毒滴度为:3.80×108Tu/ml,阴性对照病毒滴度为:6.51×108Tu/ml。
夜上海论坛1.1.2细胞培养用含10%小牛血清、1%的青/链霉素双抗的RPMI1640培养基于37℃,5%CO2的培养箱中培养SGC-7901细胞,每3天按1∶3的比例传代。
夜上海论坛1.1.3慢病毒转染SGC-7901细胞实验共分为3组:实验组(STAT3-shRNA转染组)、阴性对照组(空病毒载体转染组)、空白对照组(正常SGC-7901细胞)。SGC-7901细胞按1×106个/孔均匀接种至6孔板,长至汇合度为30%~40%时,加入慢病毒(感染复数MOI=20),12h后更换为新鲜的无病毒培养基。
夜上海论坛1.1.4激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)各组细胞按2×103个/孔均匀接种至装有灭菌爬片的24孔板中,48h后弃培养基,PBS溶液洗3次,4%多聚甲醛固定10min,轻轻取出爬片并倒扣于载玻片上,甘油封片后用激光共聚焦显微镜观察。
1.1.5Real-timePCR检测STAT3基因表达收集各组细胞1×106个,trizol法抽提总RNA,紫外分光光度计测RNA纯度及浓度后逆转录为cDNA,反应条件为:42℃60min,95℃5min,5℃5min。取2μlcDNA模板进行PCR。STAT3上游引物序列为:5’-GAGGACTGAGCATCGAGCA-3’,下游引物序列:5’-CATGTGATCTGACACCTGAA-3’,扩增产物长85bp;内参引物β-actin上游序列为:5’-CTGGAACGGTGAAGGT-GACA-3’,下游引物序列:5’-AAGGGACTTCCTGTAACAATG-CA-3’,扩增产物长140bp。PCR反应条件:95℃30s,95℃5s及60℃30s共循环40次。每个样本设3个复孔,采用2-ΔΔCt公式比较mRNA相对表达水平,ΔCt=目的基因Ct值-内参基因Ct值。
1.1.6Westernblot检测STAT3、Bcl-2、survivin及Mcl-1蛋白表达收集各组细胞,裂解缓冲液(裂解液∶蛋白酶抑制剂混合物=500∶2)冰上裂解15~20min,4℃、12000r/min离心15min以分离细胞碎片。BCA蛋白定量法测蛋白浓度,加入上样缓冲液煮沸至完全变性。50μg总蛋白提取物在10%SDS-PAGE凝胶上分离,然后转至PVDF膜(90V,1.5h)。室温下用含5%脱脂奶粉的TBST溶液孵育1h以阻断非特异性结合,一抗(STAT3稀释比例为1∶2000,Bcl-2、survivin及Mcl-1稀释比例为1:200)4℃孵育过夜,TBST洗膜3次×5min;二抗(1∶2500)37℃孵育2h,TBST洗膜3次×5min,最后用ECL化学发光法显影。应用QuantityOne软件分析图像,蛋白相对表达强度用目的基因条带灰度值/β-actin条带灰度值表示。
1.1.7MTT法分析5-Fu的化疗敏感性将细胞均匀接种至96孔板(5×103个/孔),贴壁后加入5-Fu至终浓度分别为0、5、10、15、20、50、100μg/ml,每个浓度设3个复孔。48h后每孔加20μl5mg/ml的MTT溶液,37℃孵育4h,弃培养基,每孔加150mlDMSO溶液。摇床上震荡15min,用酶标仪测定570nm处吸光度值(absorbance,A)。以不加5-Fu组作对照,计算各组细胞的增殖抑制率,公式为:增殖抑制率(100%)=[对照组A570nm-实验组A570nm]/对照组A570nm×100%。
1.1.8流式细胞仪比较细胞凋亡差异细胞接种至6孔板,贴壁后加入5-Fu至终浓度为20μg/ml。48h后,收集4×105个细胞,PBS洗涤2遍后用195μlAnnexinV-PE结合缓冲液重悬细胞,加入5μlAnnexinV-PE(带红色荧光),混匀后室温下避光孵育10min,离心弃上清,加入200μl结合缓冲液,尽快送流式细胞仪检测。
1.2统计学处理实验均重复3次,使用统计分析软件SPSS17.0处理数据,用均数±标准差(x±s)表示数据,以单因素方差分析法比较多组间差异,组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。
2结果
2.1GFP在SGC-7901细胞中的表达慢病毒感染SGC-7901细胞后,在激光共聚焦显微镜下观察到细胞生长状态良好,可见实验组及阴性对照组均有明显GFP表达(图1)。
2.2STAT3-shRNA转染后STAT3mRNA及蛋白表达情况Real-timePCR结果(表1)所示,阻断STAT3信号后,STAT3mRNA相对表达水平下降为0.46±0.04,明显低于空白对照组1.00±0.01、阴性对照组0.93±0.05(P<0.05)。免疫印迹结果(图2、表1)显示,STAT3蛋白相对表达强度在空白对照组、阴性对照组及实验组中依次为0.78±0.07、0.75±0.05、0.47±0.04,表明STAT3-shRNA可明显下调STAT3蛋白活性(P<0.05),而阴性对照组和空白对照组之间无明显差异(P=0.528)。
2.3抑制STAT3表达后SGC-7901细胞对5-Fu的敏感性MTT结果(表2)示,与阴性对照组及空白对照组相比,实验组细胞增殖抑制率明显升高(P<0.05),表明STAT3-shRNA能抑制细胞增殖,增强细胞对5-Fu的化疗敏感性。
夜上海论坛2.4慢病毒介导shRNA抑制STAT3后细胞凋亡率的变化抑制STAT3后细胞凋亡率(39.16±2.25)%,较阴性对照组(23.43±2.86)%、空白对照组(23.75±1.23)%明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),表明抑制STAT3表达能增强5-Fu的凋亡诱导作用(表3)。
2.5STAT3信号通路阻断后抗凋亡蛋白表达情况Westernblot结果表明(图3、表4),Bcl-2、Mcl-1及sur-vivin的蛋白表达水平在实验组中分别为0.47±0.03、0.35±0.02、0.45±0.02,空白对照组中为0.81±0.06、0.52±0.05、0.71±0.03,阴性对照组为0.78±0.07、0.49±0.01、0.67±0.05。与阴性对照组相比,实验组上述蛋白水平分别下调约40%、29%、33%(P<0.05),而两对照组之间无统计学差异(P>0.05)。
3讨论
5-Fu是胃癌化疗的一线药物,其通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶影响DNA的生物合成,属于抗代谢类化疗药物,然而其疗效往往因癌细胞夜上海论坛获得多药耐药性(multidrugresistance,MDR)而受到极大影响[4]。MDR的形成机制十分复杂,耐药蛋白过表达、细胞凋亡异常、转录因子活化、药物代谢异常等皆可诱导MDR。研究证明,化疗药物发挥细胞毒性作用的主要机制是诱导凋亡,可由于肿瘤细胞内在的抗凋亡程序激活,使得其对化疗药物耐受,最终导致化疗失败[5]。STAT3作为络氨酸信号通路中的重要转录因子,通过调控多个下游靶分子介导细胞的增殖、分化及凋亡。在正常细胞中,STAT3的活化快速而短暂,而在肿瘤细胞中STAT3却能异常的持续活化,促进细胞不断增殖,抑制凋亡,诱导肿瘤血管生成及免疫逃逸,最终促进肿瘤发生与发展。Bcl-2、Mcl-1、survivin均是STAT3通路下游的靶基因,其中Bcl-2及Mcl-1是Bcl-2家族蛋白的主要成员,依赖线粒体途径抑制促凋亡因子的释放,抑制细胞凋亡[6];survivin则是凋亡抑制蛋白(IAPs)家族成员,主要依赖Caspase途径抑制细胞色素C释放从而抑制凋亡[7]。近来的研究认为,STAT3的异常活化与肿瘤细胞耐药有关,抑制STAT3可逆转细胞的化疗抵抗性。Liu等和Gu等[9]分别在黑色素瘤及头颈部鳞癌中发现,耐药细胞中STAT3表达水平较不耐药细胞明显上调,沉默STAT3可抑制肿瘤生长,逆转耐药细胞的化疗抵抗性。Duan等[10]发现,转染IL-6(STAT3的活性配体)可诱导卵巢癌细胞对紫杉醇耐药,利用siRNA沉默STAT3可增强紫杉醇的抗肿瘤活性。目前,STAT3沉默对胃癌细胞化疗敏感性影响的研究相对甚少,鉴于此,本实验拟阻断胃癌SGC-7901细胞的STAT3信号通路,观察5-Fu化疗敏感性的变化。
RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术是利用体外合成的RNA序列特异性地结合并降解同源目的mRNA,使目的基因功能完全或部分丧失的生物学过程,可通过2种途径实现:一种是直接向细胞转染小干扰RNA(siRNA),另一种则是通过质粒、病毒或细菌载体将短发夹RNA(shRNA)传递至靶细胞[11]。siRNA由于存在易被血清核糖核酸酶降解、稳定性差、转运效率差等不足之处,因此本实验选择更加特异、稳定的shRNA以抑制靶基因表达。本研究通过构建靶向STAT3基因的慢病毒载体,介导shRNA转染SGC-7901细胞,在激光共聚焦显微镜下可观察到明显的GFP表达,real-timePCR及免疫印迹结果表明干扰后STAT3mRNA表达抑制率约为54%,蛋白水平下降达40%,说明STAT3在基因及蛋白水平均得到有效抑制。MTT及流式细胞仪检测发现STAT3-shRNA可增强5-Fu的增殖抑制及凋亡诱导作用,提示SGC-7901细胞对5-Fu的化疗敏感性升高。为了阐明其化疗增敏的机制,进一步检测了STAT3下游靶分子Bcl-2、Mcl-1、survivin蛋白的表达,发现三者的活性均明显下调,这与Liu[12]、Wen等[13]的实验结果一致,说明STAT3-shRNA能通过抑制STAT3表达进而下调该通路下游的抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1、survivin的活性,诱导肿瘤细胞凋亡,使5-Fu的抗肿瘤活性增强。
夜上海论坛总之,慢病毒介导的STAT3-shRNA能靶向抑制SGC-7901细胞中STAT3基因表达,通过阻断STAT3信号通路使下游的抗凋亡信号Bcl-2、Mcl-1、survivin的表达下降,促进细胞凋亡,在一定程度上提高胃癌细胞对5-Fu的化疗敏感性。本实验结果表明,靶向STAT3的基因治疗联合化疗,能逆转胃癌细胞对5-Fu的抵抗性,有可能成为胃癌治疗的有效新途径。但本实验仅为初步的体外实验,肿瘤细胞的耐药是涉及多种机制的复杂过程,尚需进一步开展动物实验验证。
作者:钟竹周伟吴小翎单位:重庆医科大学附属第二医院消化内科重庆市肿瘤医院放疗科